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完美工作

SLC32A1（ImmunoStar 的 VIAAT 抗体 # 20092）首次在大鼠大脑上工作完美。我们认为最佳抗体稀释度为 1:20000。我包括了我们的抗体成像结果（见上图）。

SLC32A1 免疫组织化学染色方案：

第 1 天：1。用 ImmEdge Pen（防水记号笔）a 绘制幻灯片轮廓。它使外部疏水 => 允许您使用更少的抗体并防止 b。使用移液器测量 PBS 溶液覆盖轮廓幻灯片 2 的舒适程度。在 PBS 中洗涤切片 1×5 分钟（摇匀）a。使用带 PBS 的绿色盒子和带载玻片架的浸没载玻片 b。倾倒溶液时，将载玻片放在塑料表面 b/c 纸巾上。准备封闭液。用搅拌器在烧杯上搅拌（Triton 很难溶解）。准备后，将多余的放在冰上。根据二抗所在的位置选择血清被饲养（如果在山羊中饲养使用 NGS，如果马使用 NHS）a。使用带纸巾的矩形盒子，底部用 PBS 轻轻浸泡。准备在步骤 7c 中使用时，仅取出一抗等分试样。前任。 7.5 mL Blocking Soln：10% 血清 + 3% BSA + 0.5% Triton + PBS 传播（~350 µL/幻灯片）往往有粘附在幻灯片表面的纤维。 750μL 血清（正常马血清 [NHS] 或正常山羊血清 [NGS]）ii。 1125μL BSA（PBS 中的 20%）[牛血清]iii。 37.5μ L Tritoniv。 5.59 毫升 PBS4。取出一半的封闭溶液，留作一抗溶液 5。应用原始未稀释的封闭溶液 (#6) 90 分钟6。取溶液 (#7)，与一抗 7 混合。应用抗体溶液并在 +4 C 下孵育过夜

第 2:1 天。在 PBS 中清洗切片 3×5 分钟（摇匀）2。应用二抗溶液 60 分钟。在冰上准备。 （也在这里制作 AB 溶液，它必须在冰上休息 ≥ 30 分钟）a。前任。 5 mL 溶液：1.5% BSA + PBSi。 375μL BSA（PBS 中的 20%）ii。 4625μL PBIII。 25 μ L 抗兔抗体（1:200）3．在 PBS 中洗涤切片 3×5 分钟（摇匀）4。应用 Vectastain A & B w/ PBS 60 分钟（摇动@constant speed = 2）a。前任。每 2.5 mL PBS 加 1 滴 A 和 1 滴 B（5 mL PBS 加 2 滴）i。 50 μ L = 1 滴ii。 20 μ L => 1 mL 的 PBSb。使用前至少 30 分钟准备溶液 => 允许发生化学反应。与色原 (DAB) 结合，导致反应性颜色变化5。在 PBS 中清洗切片 3×5 分钟（摇匀）6。将过滤后的 DAB 在通风橱中放置 5 分钟，然后将其置于冰上 7。用 PBS 清洗，然后让载玻片过夜干燥

第 3:1 天。将幻灯片放在玻璃幻灯片 holder2 中。将载玻片浸入通风橱下的旧二甲苯溶液中 510 分钟3。在通风橱下将载玻片浸入新的二甲苯溶液中 510 分钟4。取出一张盖玻片5。从二甲苯溶液中的支架中取出一张单独的幻灯片，并将其放在盖玻片附近。通过快速涂抹样品涂上胶水 7。将盖玻片浸入二甲苯中并将其放在载玻片上 8.均匀地按压盖玻片，将胶水涂抹在载玻片上。确保盖玻片不会挂在幻灯片的两侧。在二甲苯中快速冲洗幻灯片以去除多余的胶水 10。让它在通风橱下晾干过夜

提交人：

Neal Rakesh纽约医学院医学博士候选人

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